本工程中心发展了具有自主知识产权的Km表达系统。马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是一种安全的食品级酵母，它已经通过了美国和欧洲的GRAS和QPS的安全认证。除了自身的安全性以外，马克斯克鲁维酵母还具有营养要求简单、生长旺盛、生物量大、适宜温度范围广，蛋白分泌量高等特点。马克斯克鲁维酵母特别适合用于制备食品级重组蛋白，在高效表达食品、饲用蛋白、和疫苗领域具有巨大的潜力。本工程中心对马克斯克鲁维酵母进行了遗传改造，构建了以营养缺陷为筛选标记的表达宿主菌株及其相对应的系列表达载体，并且实现了对于甘露聚糖酶等工业蛋白质的高效表达。

(1).马克斯克鲁维酵母营养缺陷型宿主菌株的构建

中心利用同源重组的基因敲除方法，对野生型马克斯克鲁维酵母的URA3,ADE2,HIS3基因,进行了单个敲除，两两组合敲除和全部敲除，从而获得了一系列带有不同营养缺陷型的宿主菌株（见表1）。这一系列菌株可以与带有URA3,ADE2或HIS3标记的质粒配套使用，奠定了马克斯克鲁维酵母表达系统的基础。菌株构建的具体流程参见技术报告。

表1.马克斯克鲁维营养缺陷性宿主菌株

(2).马克斯克鲁维酵母重组蛋白表达载体的构建

在获得的马克斯克鲁维酵母营养缺陷型宿主菌株FIM-1的基础上，构建了于马克斯克鲁维酵母的系列重组蛋白表达载体。表达载体分为两大类。第一类表达载体含有大肠杆菌复制序列和氨苄抗性，可以在大肠杆菌中扩增培养。这类载体包含了5种载体，这些载体含有不同的表达元件，以实现多种方式的表达。其中，PUKDN112含有菊粉酶信号肽，PUKDN117含有alpha因子信号肽，它们可用于外源蛋白的分泌表达。PUKDN115不含信号肽，用于胞内蛋白的表达。PUKDN114用于表达N端融合6His标签的胞内蛋白，PUKDN116用于表达C端融合6His标签的胞内蛋白（表2）。

表2.马克斯克鲁维酵母表达系统第一类载体

*第一类载体含有大肠杆菌复制序列和氨苄抗性，可以在大肠杆菌中扩增培养

第二类表达载体是线性化的载体，载体上所有的元件均来自于酵母。这类载体不含有大肠杆菌的序列，因此安全性更高。第二类载体与外源基因连接后，能够在酵母中正常复制、传代和表达。第二类载体包括PUKDN119和PUKDN125。其中PUKDN112含有菊粉酶信号肽，用于分泌表达。PUKDN125不含信号肽，用于胞内表达（表3）。

表3.马克斯克鲁维酵母表达系统第二类载体*

*第二类载体为线性，不含大肠杆菌序列，安全性更高

(3).马克斯克鲁维酵母表达系统的应用

将甘露聚糖酶基因插入表达载体pUKDN112中，将构建的甘露聚糖酶表达质粒转化马克斯克鲁维酵母FIM-1 中，经过稳定表达筛选后，甘露聚糖酶的表达水平提高了2-3倍，甘露聚糖酶产量达1600U/ml。